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文献解读|开发共价核酸适体用于新-冠病毒的检测和抑制

发表时间:2023-08-16  |  点击率:53

核酸适体是一段能特异性识别靶标分子的单链DNA或RNA,已被广泛用于各种生物医学应用。然而,由于适体的构象动态易变,抗环境干扰能力弱,从而影响与靶标的结合亲和力以及核酸适体-靶标复合物的稳定性,因此与商业抗体相比,核酸适体在检测和治疗方面的性能通常一般。



湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室的王丹博士为我们阐述了如何合理地设计亲电标签功能化的核酸适体通过点击化学的共价偶联技术实现新-冠病毒的灵敏检测和侵染阻断,进一步推动了适体在诊断、分子成像、疾病治疗和其他生物医学领域的应用。该研究于2023年1月2日发表于国际知-名杂志ACS Central Science (IF=18.2),题为Robust Covalent Aptamer Strategy Enables Sensitive Detection and Enhanced Inhibition of SARS-CoV-2 Proteins


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图1 该研究发表于国际期刊ACS Central Science





01

研究背景


为了提高结合适体亲和力并减少其与靶标复合物的解离,人们开发了二价或多价适体的分子组装策略,以及将疏水基团整合到适体中以增加结合能力的分子工程策略。然而,这些策略没有改变适体和靶标之间的非共价结合模式,对核酸适体的结合亲和力以及核酸适体-靶标复合物稳定性的提升有限。目前共价核酸适体的概念和应用还处于起步阶段,并没有被广泛开发和认识。因此,促进共价核酸适体概念的开发和扩大共价核酸适体的应用领域将是非常重要的。



02

工作设计



为解决上述问题,作者将三种亲电性官能团与核酸适体偶联以开发共价核酸适体,作为SARS-CoV-2 蛋白的检测探针和功能性阻断中和剂(图2)。三种共价核酸适体分别为硫酰氟修饰的适体(SF-Apt),N-羟基琥珀酰亚胺修饰的适体(NHS-Apt)以及丙烯酰胺修饰的适体(Acr-Apt)。作为概念验证,作者选择SARS-CoV-2的核衣壳蛋白 (NP) 和刺突蛋白受体结合域 (RBD)作为研究对象探究共价核酸适体性能。NP 是 SARS-CoV-2 最保守和最-丰富的结构蛋白,是早期检测和可靠诊断的最-佳选择。RBD是SARS-CoV-2识别和感染宿主ACE2蛋白的关键蛋白。


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图2 基于共价适配体的策略,通过特异性

近距离交联来检测和阻断靶蛋白



03

研究结果


NO-1

候选共价适体的合成和表征


首先,作者选择了3种亲电能力各异的共价标签,合成了三种备选的共价核酸适体。然后通过凝胶电泳实验综合分析了交联反应效率、特异性和速率,发现中等亲电能力的NHS标记的共价核酸适体表现最佳,将其选为后续应用的探针。(图3)


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图3 三种候选共价适配体的合成和表征




NO.2

N蛋白共价适体的性能表征


然后作者测试了共价核酸适体、传统核酸适体以及抗体与NP的亲和力。结果表明:与传统核酸适体相比,共价核酸适体的解离速率常数Koff降低了2个数量级左右,亲和力(Kd)提高了30-60倍左右,与抗体相当甚至优于抗体。共价适体-NP复合能耐受多次洗涤、EDTA和尿素等环境因素的干扰,且对靶蛋白的结合具有优异的选择性。(图4)


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图4 共价适配体策略具有更强的抗环境

干扰能力和更高的特异性结合能力


NO.3

基于共价适体的N蛋白ELISA检测


接下来,作者比较了共价核酸适体ELISA、核酸适体ELISA和抗体ELISA检测NP的性能。在严格洗涤条件下,共价核酸适体ELISA的检测限(8.70pg/mL)和线性范围(81–2187pg/mL)均优于抗体ELISA的检测限(70.0pg/mL)和线性范围(81–19683pg/mL)。另外,在严格的洗涤条件下,共价核酸适体ELISA具有更好的检测特异性。(图5)


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图5 在不同的洗涤缓冲液下使用各种探针检测NP


NO.4

RBD蛋白共价适体的性能表征


接着,作者研究了RBD共价适体的结合和交联性能。研究发现RBD适体偶联上NHS标签后,亲和力提高了25倍,结合速率显著提升且从靶标处的脱落速率显著下降,此外共价核酸适体在生理Mg2+浓度下也能高效结合RBD蛋白。这十分有利于共价适体对新-冠病毒蛋白的中和和新-冠病毒的侵染阻断。(图6)


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图6 共价交联提高适配体的结合性能并减少靶标结合处的脱落




NO.5

共价RBD核酸适配体的结合能力


最后,作者研究了共价核酸适体、抗体和核酸适体阻断RBD与ACE2结合的能力。结果表明共价核酸适体阻断RBD-ACE2结合的能力(IC50=0.42nM)显著优于与抗体(IC50=1.19nM)和核酸适体(IC50=21.5nM),结合速率更快且脱落速率更慢。因此,在模拟血管和剪切应力的循环流动装置中,共价核酸适体比抗体和核酸适体具有更强的能力阻断RBD和ACE2的结合。在新冠假病毒中和实验中,共价核酸适体的半数中和浓度仅需约2nM, 最高中和效率达到95%,对比之下,抗体的半数中和浓度约6nM, 最高中和效率83%。(图7)


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图7 共价交联策略提高了RApt恶劣环境下介导的阻断能力





04

结论和展望


2022年的Nobel化学奖颁给了点击化学和生物正交化学,本研究正是利用活性很高的“Click"基团,并基于邻近驱动的共价偶联策略实现了对新-冠病毒的灵敏检测和高效中和。共价策略通过将适体与靶蛋白之间的非共价结合模式转化为共价结合模式,增强了识别能力并降低了解离速率,能进一步推动适体在诊断、分子成像、疾病治疗和其他生物医学领域的应用。这项研究得到了国家自然科学基金、 国家重点研发计划、浙江省自然科学基金、中国博士后科学基金和德国亚历山大·洪堡研究基金的资助和支持。



本研究所用普诺赛产品

产品名称

产品货号

L-谷氨酰胺溶液(200mM),100×

PB180420



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